Metoda brze ekstrakcije DNK mikrokolona je dizajnirana da izoluje ukupnu DNK iz krvi, plazme, pljuvačke, urina, ćelijskih kultura i svih ćelijskih peleta u puferu. Visoka čistoća izolovane DNK omogućava joj da se koristi za sve vrste analiza.

vrijeme izolacije je 30 do 45 minuta u zavisnosti od broja uzoraka;

• efikasno vezivanje DNK za membranu kolone omogućava dobijanje najvećeg prinosa DNK iz uzorka;
• visok stepen prečišćavanja postiže se zahvaljujući optimizovanom sastavu komponenti rastvora za liziranje i pranje;
• značajno smanjena fragmentacija i gubitak DNK tokom pranja u poređenju sa drugim metodama ekstrakcije sorbentom;
• moguće je izvršiti koncentraciju DNK smanjenjem volumena otopine za eluiranje;
• izolacija DNK na kolonama značajno smanjuje potrošnju dodatne plastike;
• maksimalni volumen uzorka - 200 µl;
• komplet sadrži proteinazu K;
• čistoća izolovane DNK je 1,8-1,9 prema odnosu A260/A280;
• količina izolovane DNK zavisi od vrste i količine uzorka. Prinos DNK iz 200 µl krvi u prosjeku iznosi 5-6 µg.

Set reagenasa za ekstrakciju genomske DNK "DNA-Extran"

Koristeći komplete za ekstrakciju genomske DNK serije DNA-Extran, moguće je izolovati DNK iz različitog biološkog materijala: krvi, kultura bakterijskih i životinjskih ćelija, svježih, smrznutih ili osušenih tkiva životinja i biljaka.

• potpuna ekstrakcija DNK iz ćelija, minimiziranje gubitka i fragmentacije DNK tokom prečišćavanja;
• izolovana DNK ima visok nivo čistoće (omjer A260/A280 = 1,8-1,9) i pogodna je za PCR, restrikcijsku, hibridizaciju i druge studije;
• kompleti ne sadrže potencijalno opasne komponente kao što su fenol i hloroform, ne zahtijevaju puno plastike i ne stvaraju toksični otpad.

Komplet reagensa za ekstrakciju DNK na magnetnim česticama "M-Sorb-Kada"

Prilagođeno za izolaciju DNK mikobakterija iz sputuma, ispiranja bronha, cerebrospinalne tekućine, eksudata, punktata, biopsije, urina, sekreta genitalnog trakta, ćelijskih kultura. Preliminarna obrada kliničkog materijala vrši se u skladu sa standardnim procedurama za pripremu uzoraka za mikrobiološka ispitivanja (Naredba br. 109 Ministarstva zdravlja Ruske Federacije od 21. marta 2003. „O poboljšanju mjera protiv tuberkuloze u Ruskoj Federaciji Federacije", Prilog 11 "Uputstvo o objedinjenim metodama mikrobioloških istraživanja u otkrivanju, dijagnostici i liječenju tuberkuloze"). Za inaktivaciju kliničkog materijala preporučujemo korištenje naše inaktivirajuće otopine A.

Rešenje A ubija mikobakterije u roku od 12 sati i dezinfikuje klinički materijal koji se može koristiti za dalje analize (ekstrakcija DNK, PCR, itd.). Otopina A je prilagođena posebno za tretman sputuma i u potpunosti zamjenjuje standardnu ​​proceduru primjenom NaOH-NALC otopine, ima izuzetna mukolitička svojstva. Inaktivaciona otopina A povećava prinos DNK u poređenju sa standardnom pripremom uzorka NaOH-NALC.

Postupak izolacije uključuje: lizu DNK sa gvanidin izotiocijanatom, sorpciju DNK na magnetnim česticama, sedimentaciju DNK centrifugiranjem, korake ispiranja i eluiranje DNK. Može se koristiti za izolaciju DNK drugih mikroorganizama.

upotreba magnetnih čestica obloženih silika gelom kao sorbenta je tehnološki napredniji i praktičniji format u odnosu na druge sorbente, omogućava maksimalnu standardizaciju i automatizaciju postupka ekstrakcije DNK;

interna pozitivna kontrola (IPC) se dodaje u svaki test uzorak, prisustvo/odsustvo RT-PCR inhibitora i efikasnost ekstrakcije DNK se procjenjuje reakcijom IPC amplifikacije.

Kompleti reagensa za ekstrakciju DNK iz prehrambenih proizvoda i prehrambenih sirovina

Kompleti reagensa "Sorb-GMO-A" i "Sorb-GMO-B" dizajnirani su posebno za ekstrakciju DNK iz biljnog materijala, hrane i hrane za životinje. Oba kompleta za pročišćavanje DNK koriste silicijumski sorbent. "Sorb-GMO-A" sadrži gvanidin hlorid kao sredstvo za lizu, "Sorb-GMO-B" sadrži jonski deterdžent STAB, koji obezbeđuje maksimalan prinos DNK iz biljnih komponenti. Posebne karakteristike kompleta "Sorb-GMO-A" su brzina ekstrakcije DNK i odsustvo hloroforma, što rad sa kompletom čini sigurnijim.

Komplet reagensa za ekstrakciju DNK iz uzoraka vode (na magnetnim česticama) "M-Sorb-Leg"

Dizajniran za izolaciju DNK legionele iz vodnih tijela okoliša (rashladni tornjevi, bazeni, vodeni parkovi, sistemi za dovod tople i hladne vode). Minimalna otkrivena koncentracija legionele je 100 ćelija na 0,5 L uzorka.

Set "M-Sorb-Leg" se proizvodi u dvije modifikacije: "M-Sorb-Leg1000" za uzorke vode zapremine 1-1000 ml i "M-Sorb-Leg1" za uzorke vode do 1 ml. M-Sorb-Leg1000 set omogućava filtriranje vode pomoću polikarbonatnog filtera.

set reagensa "M-Sorb-Leg" omogućava vam da se riješite PCR inhibitora prisutnih u visoko kontaminiranim uzorcima vode;

• Tehnika izolacije DNK temelji se na sorpciji DNK na magnetnim česticama obloženim silika gelom nakon čega slijedi precipitacija sa reagensom za taloženje. Kombinira prednosti metode sorpcije i metode totalne precipitacije;
• interna pozitivna kontrola (IPC) se dodaje u svaki test uzorak, a prisustvo/odsustvo RT-PCR inhibitora se procjenjuje reakcijom amplifikacije IPC.

Set reagenasa za ekstrakciju DNK iz objekata okoline (na magnetnim česticama) "M-Sorb-OOM"

M-Sorb-OOM komplet reagensa je dizajniran da izoluje DNK iz objekata okoline (zemlja, vode, leševa životinja, itd.) za koje se sumnja da su zaraženi visoko opasnim mikroorganizmima (OOM), kako bi ih pripremio za naknadnu analizu stvarnom- vremenski PCR. Procedura ekstrakcije je slična onoj opisanoj za set M-Sorb-Leg.

Komplet reagensa za izolaciju RNK "RNA-Extran"

Komplet je namijenjen za izolaciju RNK iz krvi, fragmenata tkiva, staničnih kultura. RNK dobijena korišćenjem RNA-Extran kita može se koristiti i za RT-PCR i za analizu hibridizacije, in vitro translaciju i kloniranje.

Princip izolacije RNK zasniva se na ekstrakciji kiselog fenola prema Chomchinskyju, u kojoj samo RNK ostaje u vodenoj fazi, a DNK u kombinaciji sa proteinima prelazi u organsku fazu. Gvanidin tiocijanat se koristi kao agens koji izoluje i denaturira ćelijske nukleaze.

omogućava dobijanje visoko prečišćene RNK, bez DNK nečistoća;

omogućava potpunu ekstrakciju RNK iz pune krvi, fragmenata tkiva i ćelijskih kultura;

omogućava vam da dobijete netaknutu RNK;

• Vrijeme ekstrakcije RNK - 1 sat.

Kataloški broj	naslov	broj reakcija
EX-509	Komplet reagensa “DNA-Extra-1” za izolaciju genomske DNK iz pune krvi	100
EX-511	Komplet reagensa “DNA-Extran-2” za ekstrakciju DNK iz životinjskih i ljudskih tkiva	100
EX-512	Komplet reagensa “DNA-Extran-3” za ekstrakciju DNK iz bakterijskih kultura	100
EX-513	Komplet reagensa “DNA-Extra-4” za ekstrakciju DNK iz biljnih tkiva	100
EX-514	Komplet reagensa “K-Sorb” za izolaciju ukupne DNK na kolonama (iz krvi, pljuvačke, urina, ćelijskih kultura, struganja epitelnih ćelija)	100
EX-515	Komplet reagensa "RNA-Extra" za izolaciju RNK iz krvi, tkiva, ćelijskih kultura	50
OM-505	Komplet reagensa “M-Sorb-Tub” za ekstrakciju DNK iz kliničkih uzoraka i staničnih kultura (na magnetnim česticama)	50 ili 100
GM-502-50	“SORB-GMO-A” (gvanidin + sorbent) Set reagensa za ekstrakciju DNK iz biljnih sirovina i prehrambenih proizvoda	50
GM-503-50	“SORB-GMO-B” (CTAB + sorbent) Set reagensa za ekstrakciju DNK iz biljnih sirovina i prehrambenih proizvoda	50
OM-506	Komplet reagensa “M-Sorb-Leg1000” za izolaciju DNK legionele iz uzoraka vode do 1000 ml (na magnetnim česticama filteri se isporučuju zasebno)	50 ili 100
OM-507	Komplet reagensa “M-Sorb-Leg1” za izolaciju DNK legionele iz uzoraka vode do 1 ml (na magnetnim česticama)	50 ili 100
OOM-502	Komplet reagensa “M-sorb-OOM” za ekstrakciju DNK iz objekata okoline (na magnetnim česticama)	50 ili 100

Informacije o narudžbi

Ime	Volume	Proizvodnja	Metoda	Cat.Br
“GMO-MagnoSorb” (gvanidin + magnetni sorbent) Set reagensa za ekstrakciju DNK iz biljnih sirovina i prehrambenih proizvoda	50 sekreta	Synthol	PCR u realnom vremenu	GM-505-50
“SORB-GMO-A” (gvanidin + sorbent) Set reagensa za ekstrakciju DNK iz biljnih sirovina i prehrambenih proizvoda	50	Synthol	PCR u realnom vremenu	GM-502-50-50
“SORB-GMO-B” (CTAB + sorbent) Set reagensa za ekstrakciju DNK iz biljnih sirovina i prehrambenih proizvoda	50	Synthol	PCR u realnom vremenu	GM-503-50-50
Set reagensa “Amplitub-RV” kit br. 1 (“M-Sorb-Tub”) za izolaciju DNK mikobakterija iz kliničkih uzoraka i ćelijskih kultura (na magnetnim česticama)	50	Synthol	PCR u realnom vremenu	OM-505
Komplet reagensa “DNA-Extra-1” za izolaciju genomske DNK iz pune krvi	100	Synthol	PCR u realnom vremenu	EX-509-100
Komplet reagensa “DNA-Extran-2” za ekstrakciju DNK iz životinjskih i ljudskih tkiva	100	Synthol	PCR u realnom vremenu	EX-511
Komplet reagensa “DNA-Extran-3” za ekstrakciju DNK iz bakterijskih kultura	100	Synthol	PCR u realnom vremenu	EX-512-100
Komplet reagensa “DNA-Extran-3” za ekstrakciju DNK iz biljnih tkiva	100	Synthol	PCR u realnom vremenu	EX-513-100
Komplet reagensa “K-Sorb” za izolaciju ukupne DNK na kolonama (iz krvi, pljuvačke, urina, ćelijskih kultura, struganja epitelnih ćelija)	100	Synthol	PCR u realnom vremenu	EX-514-100
	48 reakcija	Synthol	PCR u realnom vremenu	GM-443-48
Soya / 35S+FMV / NOS set reagensa za skrining	50 reakcija	Synthol	PCR u realnom vremenu	GM-416-50

""DNA-sorb-S-M" ® AmpliSense FBUN Centralni istraživački institut za epidemiologiju Rospotrebnadzora, Samo za istraživanja Ruska Federacija, 111123 i druge nemedicinske svrhe, grad Moskva, ..."

INSTRUKCIJE

o upotrebi kompleta reagensa

za ekstrakciju DNK iz biološkog materijala

"DNK-sorb-S-M"

AmpliSense

Centralni istraživački institut za epidemiologiju FBUN

Rospotrebnadzor,

Samo za istraživanje

Ruska Federacija, 111123,

i druge nemedicinske svrhe

Moskva, ulica Novogireevskaja 3A

LISTA SKRAĆENICA

SVRHA

PRINCIP METODE

PAKET OBRASCI

VAĐENJE DNK IZ BIOLOŠKOG MATERIJALA OD ŽIVOTINJA................................. 8

ŽIVOTINJSKA ILI BILJNA HRANA

SIMBOLI KORIŠTENI U ŠTAMPANIM PROIZVODIMA

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 2 od 15

LISTA SKRAĆENICA

U ovom priručniku koriste se sljedeće skraćenice i simboli:

DNK - dezoksiribonukleinska kiselina NA - nukleinske kiseline TC - negativna kontrola ekstrakcije NCO - negativna kontrola uzorak PC - pozitivna kontrola ekstrakcije PKO - pozitivna kontrola uzorak PCR - lančana reakcija polimeraze

– Savezna budžetska institucija za nauku

FBUN CRI

"Centralni istraživački institut za epidemiologiju epidemiologije" Federalne službe za nadzor u sferi Rospotrebnadzora za zaštitu prava potrošača i dobrobit ljudi

SVRHA

Set reagensa "DNA-sorb-S-M" je namenjen za ekstrakciju DNK iz biološkog materijala životinja: tkiva (biopsija (koža i sluzokože genitourinarnog sistema, gastrointestinalnog trakta, bronhija), hirurški i obdukcioni) materijal; i ekstrakcija DNK iz hrane, bioloških aditiva, stočne hrane ili biljnog materijala za naknadnu analizu lančanom reakcijom polimeraze (PCR).

Ekstrakcija DNK je preanalitička procedura PCR metode.

Volumen uzorka za ekstrakciju: 100 µl (mogu se testirati uzorci zapremine od 10 do 100 µl ili težine od 10 do 100 mg)1.

PAŽNJA! Za informacije o postupku prikupljanja, uslovima za transport i skladištenje test materijala, potrebi i postupku pripreme za ekstrakciju DNK, kao i informacije o interferirajućim supstancama i ograničenjima vezanim za uzorak, pogledajte uputstva za korišćeni komplet reagenasa za amplifikacija .

PRINCIP METODE

Ispitni uzorak 2 tretira se rastvorom za lizu sa proteinazom K, što dovodi do razaranja ćelijskih membrana, oslobađanja NA i ćelijskih komponenti. Otopljeni NA se vezuju za čestice sorbenta, dok ostale komponente liziranog test materijala ostaju u rastvoru i uklanjaju se tokom taloženja sorbenta.U zavisnosti od materijala za ispitivanje, pogledajte uputstva za korišćeni komplet za pojačavanje.

Za neke vrste biološkog materijala potreban je korak pripreme uzorka. Cm.

upute za korišteni komplet reagenasa za pojačavanje.

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 3 od 15 centrifugiranjem i naknadnim ispiranjem sorbenta. Kada se pufer za eluiranje doda sorbentu, NC prelazi sa površine silicijum dioksida u rastvor, koji se odvaja od čestica sorbenta centrifugiranjem. Kao rezultat ove procedure dobija se visoko prečišćen NA preparat, bez inhibitora reakcije amplifikacije, što obezbeđuje visoku analitičku osetljivost PCR studije.

PAKET OBRASCI

Komplet reagensa dostupan je u 2 konfiguracije:

Obrazac 1 uključuje set reagensa "DNA-sorb-S-M" verzija 50.

Obrazac 2 uključuje set reagensa "DNA-sorb-S-M" verzija 100.

SIGURNOSNE MJERE I INFORMACIJE O ODLAGANJU

Prilikom ispitivanja biološkog materijala od životinja, rad treba obavljati u skladu sa pravilima Ministarstva poljoprivrede Ruske Federacije od 27. januara 1997. br. 13-7-2 / 840 „Pravila za rad u dijagnostičkim laboratorijama koje koriste polimerazu metoda lančane reakcije. Osnovne odredbe” odobrene od strane Veterinarskog odjela.

Prilikom proučavanja prehrambenih proizvoda, bioloških aditiva, stočne hrane ili biljnih sirovina, rad se mora obavljati u skladu sa zahtjevima smjernica MU 1.3.2569-09 „Organizacija rada laboratorija primjenom metoda amplifikacije nukleinske kiseline pri radu s materijalom koji sadrže mikroorganizme grupe patogenosti I–IV "i GOST R 53214-2008" Prehrambeni proizvodi. Metode analize za detekciju genetski modificiranih organizama i proizvoda dobivenih od njih.

Opšti zahtjevi i definicije”.

Prilikom rada morate se uvijek pridržavati sljedećih zahtjeva:

– Laboratorijski proces treba da bude jednosmjeran. Analiza se vrši u odvojenim prostorijama (zonama). Radovi bi trebali započeti u zoni ekstrakcije i nastaviti u zoni pojačanja i detekcije. Nemojte vraćati uzorke, opremu i reagense u područje gdje je obavljen prethodni korak procesa.

– Neiskorišteni reagensi, reagensi kojima je istekao rok trajanja i Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 4 od 15 korištenih reagensa, ambalaže3, biološkog materijala, uključujući materijale, instrumente i predmete kontaminirani biološki materijal treba odložiti u skladu sa zahtjevima SanPiN 2.1.7.2790-10 "Sanitarni i epidemiološki zahtjevi za upravljanje medicinskim otpadom".

– Koristite i mijenjajte pri svakoj operaciji jednokratne nastavke za automatske pipete sa filterom4. Plastični pribor za jednokratnu upotrebu mora se baciti u poseban kontejner koji sadrži sredstvo za dezinfekciju koje se može koristiti za dekontaminaciju medicinskog otpada.

– Pribor (malter i tučak) i metalni instrumenti (skalpeli, makaze, pincete, nastavci za blender, itd.) koji se koriste za pripremu uzoraka drže se u dezinfekcionom rastvoru (na primer, 0,2% rastvor natrijeve soli dihloroizocijanurske kiseline) jedan sat, peru vodom iz slavine sa površinski aktivnim deterdžentima i nakon pranja u tekućoj i dejonizovanoj vodi sušiti u komori za suvo grijanje 4 sata na temperaturi od 180 C.

– Komplet reagensa je namijenjen za jednokratnu upotrebu za testiranje određenog broja uzoraka (pogledajte odjeljak „Sastav“).

– Komplet reagensa je spreman za upotrebu prema ovim uputstvima.

Koristite komplet reagensa isključivo za njegovu namjenu.

– Nemojte koristiti komplet reagensa ako je unutrašnje pakovanje slomljeno ili izgled reagensa nije kako je opisano.

– Nemojte koristiti komplet reagensa ako nisu poštovani uslovi transporta i skladištenja u skladu sa uputstvima.

Neiskorišteni reagensi, reagensi kojima je istekao rok trajanja, korišteni reagensi, ambalaža klasifikovani su u klasu opasnosti medicinskog otpada G.

Vrhovi za jednokratnu upotrebu bez filtera se koriste za uklanjanje supernatanta tokom ekstrakcije vakuumskim aspiratorom.

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 5 od 15

– Nemojte koristiti komplet reagensa nakon isteka roka trajanja.

– Koristite jednokratne rukavice bez pudera, laboratorijske mantile i zaštitu za oči kada rukujete uzorcima i reagensima. Na kraju rada dobro operite ruke. Sve operacije se izvode samo u rukavicama kako bi se izbjegao kontakt s ljudskim tijelom.

– Izbegavati udisanje para, kontakt sa kožom, očima i sluzokožom, ne gutati. U slučaju kontakta, odmah isperite zahvaćeno područje vodom i potražite medicinsku pomoć ako je potrebno.

– Sigurnosni listovi za reagens (SDS) dostupni su na zahtjev.

Procjena vjerovatnih događaja, uslijed kojih mogu nastati negativne posljedice po ljudski organizam:

Kada se koristi za predviđenu svrhu i uz pridržavanje gore navedenih mjera opreza, isključen je kontakt s ljudskim tijelom.

U vanrednim situacijama moguće je sljedeće:

- iritacija sluzokože očiju kod osetljivih osoba,

– iritacija kože kod osetljivih osoba,

- alergijska reakcija,

- šteta udisanjem,

- šteta kada se uzima oralno.

Specifični efekti kompleta reagensa na ljudski organizam:

– Nema kancerogenog efekta.

- Nema mutagenog efekta.

– Nema reproduktivnu toksičnost.

DODATNI MATERIJALI I OPREMA

(sa naznakom proizvođača/dobavljača):

1. Jednokratne epruvete od 1,5 ml i 5,0 ml od polipropilena ili sa čvrstim čepom (npr. Axygen, Inc.

(Exgen, Inc.), SAD ili ekvivalentno).

2. Jednokratni vrhovi za pipete promjenjive zapremine sa filterom do 200 i do 1000 µl (na primjer, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), SAD ili slično).

3. Jednokratni vrhovi za pipete promjenjivog volumena do 200 µl (npr. Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), SAD ili slično).

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 6 od 15

4. Stalci za tube od 1,5 ml (na primjer, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), SAD ili slično).

5. Laminarna kutija, klasa biološke sigurnosti II tip A (na primjer, "BAVp-01-"Laminar-S"-1.2", CJSC "Laminar Systems", Rusija, ili slično).

6. Termostat za cijevi tipa "Eppendorf" od 25 do 100 °C (na primjer, SIA Biosan, Latvija, ili slično).

7. Termostat-tresač za cijevi tipa Eppendorf od 25 do 100 °C (na primjer, TS-100, SIA Biosan, Latvija, ili slično).

8. Mikrocentrifuga za epruvete tipa Eppendorf sa maksimalnom brzinom centrifugiranja od najmanje 12 hiljada g (na primjer, MiniSpin, Eppendorf ("Eppendorf Manufacturing Corporation"), Manufacturing Corporation Njemačka, ili slično).

9. Vortex (na primjer, SIA Biosan, Latvija, ili slično).

10. Medicinski vakuum aspirator sa bocom za uklanjanje supernatanta (na primjer, OM-1, OOO Utes, Rusija, ili slično).

11. Automatski dozatori promjenjive zapremine (na primjer, Biohit LLC, Rusija, ili slično).

12. Frižider od 2 do 8 °S sa zamrzivačem od minus 24 do minus 16 S.

13. Zasebni kućni ogrtač, kape, cipele i jednokratne rukavice prema MU 1.3.2569-09.

14. Plastične posude za jednokratnu upotrebu za oslobađanje i inaktivaciju materijala.

–  –  –

VAĐENJE DNK IZ BIOLOŠKOG MATERIJALA OD ŽIVOTINJA

2. Odaberite potreban broj polipropilenskih epruveta za jednokratnu upotrebu od 1,5 ml sa poklopcima na navoj ili poklopcima koji dobro pričvršćuju (uključujući negativne i pozitivne kontrole ekstrakcije, ako su predviđene za PCR studiju).

Prilikom skladištenja pufera za lizu i otopine za ispiranje 1 na temperaturi od 2 do 8°C može se formirati talog u obliku kristala.

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 8 od 15

3. Dodajte 10 µl VKO6 u svaku epruvetu (ako je predviđena za PCR testiranje). Dodajte 400 µl pufera za lizu i 17 µl pufera za lizu u epruvete.

4. Dozirajte 100 µl test uzoraka6 u pripremljene epruvete, koristeći poseban vrh filtera za svaki uzorak.

PAŽNJA! 400 µl pufera za lizu i 17 µl reagensa za lizu može se dodati u epruvetu sa potrebnom količinom uzorka za testiranje i 10 µl BKO7 (ako je predviđeno za PCR studiju) može se dodati u istu epruvetu koristeći odvojene vrhove filtera.

5. Dodajte 100 µl OKO u epruvetu za ekstrakciju negativne kontrole (TC), dodajte 90 µl OKO i 10 µl FKO u epruvetu za ekstrakciju pozitivne kontrole (PC) (ako su kontrole ekstrakcije predviđene za provođenje PCR studija).6

6. Čvrsto zatvorite poklopce, dobro promiješajte i promiješajte kapi.

Stavite epruvete u termostat na 64°C u trajanju od 1 sata, periodično vrteći (5 puta svakih 10-12 minuta). Inkubacija je dozvoljena 12 sati na 60 °C.

7. Sedimentirajte neotopljene čestice uzorka centrifugiranjem 5 minuta na 10 kg (npr. 12 krpm za mikrocentrifugu MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Uklonite supernatant u zapremini od 200-350 µl veoma pažljivo (izbegavajući ulazak suspendovanih čestica i kapljica masti) posebnim vrhovima sa filterima i prebacite u nove epruvete. Taloženje kapi na vorteksu.

9. Resuspendirajte univerzalni sorbent intenzivnim miješanjem na vorteksu. Dodajte 25 µl resuspendiranog univerzalnog sorbenta u svaku epruvetu sa posebnim vrhom, dobro zatvorite poklopce.

Vortex, ostavite u rešetki 10 minuta, miješajući svake 2 minute.

Dozvoljeno je mijenjati volumen testnih i kontrolnih uzoraka, pogledajte upute za korišteni komplet reagensa za pojačavanje.

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 9 od 15

18. Ponovite postupak pranja, slijedeći paragrafe. 15–16, potpuno uklonite supernatant.

19. Stavite epruvete sa otvorenim poklopcima u termostat na 64 °C na 5–10 min da se univerzalni sorbent osuši.

20. Dodajte 50–100 µl pufera B za eluiranje u epruvete (pogledajte uputstva za korišćeni komplet reagensa za pojačavanje).

Vrtite dok se sorbent potpuno ne suspenduje. Stavite u termostat sa temperaturom od 64 °C na 5-10 minuta, povremeno (1 put u minuti) miješajući na vorteksu.

Prečišćena DNK može se čuvati na temperaturi od 2 do 8 °C nedelju dana, na temperaturi od minus 24 do minus 16 °C 6 meseci i na temperaturi koja ne prelazi minus 68 °C godinu dana. Da biste to učinili, potrebno je, bez hvatanja sorbenta, prenijeti supernatant u novu epruvetu.

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 10 od 15

VAĐENJE DNK IZ HRANE, BIOLOŠKI DODATKI,

ŽIVOTINJSKA ILI BILJNA HRANA

PAŽNJA! Za postupak pripreme biološkog materijala za ekstrakciju DNK i zapreminu uzorka za ispitivanje, pogledajte uputstva za komplet reagensa koji se koristi za amplifikaciju

1. Zagrijte pufer za lizu i otopinu za ispiranje 1, ako se čuva na 2 do 8°C, na 64°C dok se kristali potpuno ne rastvore.

2. Stavite epruvete od 1,5 ml sa prethodno obrađenim uzorcima za testiranje u stalak (pogledajte uputstva za komplet reagensa za pojačavanje koji se koristi za zapreminu/količinu uzorka).

3. Pripremite jednokratnu polipropilensku epruvetu od 1,5 ml sa poklopcem na navoj ili čvrsto prilepljenom negativnom kontrolom ekstrakcije (EC). Dodajte 100 µl OKO u epruvetu.

4. Dodajte 400 µl pufera za lizu i 17 µl reagensa za lizu u epruvete i OC.

5. Čvrsto zatvorite poklopce, dobro promiješajte i promiješajte kapi.

Stavite epruvete u termostat na temperaturu od 64 °C u trajanju od 1 sata, periodično vorteksirajući (5 puta svakih 10-12 minuta), ili koristite termostat-tresač.

6. Sedimentirajte neotopljene čestice uzorka centrifugiranjem 5 minuta na 10 kg (npr. 12 krpm za mikrocentrifugu MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Odaberite potreban broj novih jednokratnih polipropilenskih epruveta od 1,5 ml sa poklopcima na navoj ili čepovima koji se čvrsto pričvršćuju.

8. Resuspendirajte univerzalni sorbent intenzivnim miješanjem na vorteksu. Dodajte 25 µl resuspendiranog univerzalnog sorbenta u svaku epruvetu sa posebnim vrhom, dobro zatvorite poklopce.

9. Iz epruveta sa liziranim uzorcima vrlo pažljivo uklonite tečnost supernatanta u zapremini od 200–350 µl (izbegavajući ulazak suspendovanih čestica i kapljica masti) pomoću posebnih vrhova sa filterima i prebacite u epruvete sa sorbentom. Vortex, ostavite u rešetki 10 minuta, miješajući svake 2 minute.

Obrazac 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 11 od 15

10. Centrifugirajte epruvete u mikrocentrifugi 1 min na 2 kg (npr. 5 krpm za MiniSpin mikrocentrifugu, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Bez hvatanja sorbenta, uklonite supernatant iz svake epruvete posebnim vrhom od 200 µl bez filtera koristeći vakuum aspirator.

12. Dodajte 300 µl otopine za ispiranje 1 u epruvete, dobro zatvorite poklopce, vrtite dok se univerzalni sorbent potpuno ne suspenduje.

13. Centrifugirajte epruvete u mikrocentrifugi 1 min na 2000 g.

14. Bez hvatanja sorbenta, uklonite supernatant iz svake epruvete posebnim vrhom od 200 µl bez filtera koristeći vakuum aspirator.

15. Dodajte 500 µl otopine za pranje 2 u epruvete, dobro zatvorite poklopce, miješajte na vortexu dok se univerzalni sorbent potpuno ne suspendira

16. Centrifugirajte epruvete u mikrocentrifugi 1 min na 7 kg (npr. 10 krpm za mikrocentrifugu MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Bez hvatanja sorbenta, uklonite supernatant iz svake epruvete posebnim vrhom od 200 µl bez filtera koristeći vakuum aspirator.

18. Ponovite postupak pranja, slijedeći paragrafe. 15-16, potpuno uklonite supernatant.

19. Stavite epruvete sa otvorenim poklopcima u termostat na temperaturi od 64 °C na 5-10 minuta da se osuši univerzalni sorbent.

20. U epruvete dodati 50 µl pufera za eluiranje B. Vrtljajte dok se sorbent potpuno ne suspenduje. Stavite u termostat sa temperaturom od 64 °C na 5-10 minuta, povremeno (1 put u minuti) miješajući na vorteksu.

21. Centrifugirajte epruvete u mikrocentrifugi 1 min na 10 hiljada g. Supernatant sadrži prečišćenu DNK. Uzorci su spremni za PCR.

Prečišćena DNK može se čuvati na temperaturi od 2 do 8 °C nedelju dana, na temperaturi od -24 do -16 °C 6 meseci i na temperaturi Form 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / strana 12 od 15 ne više od minus 68 °S tokom godine. Da biste to učinili, potrebno je, bez hvatanja sorbenta, prenijeti supernatant u novu epruvetu.

DATUM ISTEKANJA, USLOVI TRANSPORTA I SKLADIŠTENJE.

Najbolje do datuma. 12 mjeseci Ne treba koristiti komplet reagensa kojem je istekao rok trajanja. Rok trajanja otvorenih reagensea je rok trajanja na etiketi za neotvorene reagense, osim ako je drugačije navedeno u uputstvu.

Prijevoz. Komplet reagensa treba transportovati na temperaturi od 2 do 8 C ne duže od 5 dana u termalnim kontejnerima koji sadrže ledene obloge svim vrstama pokrivenih vozila. Po prijemu, rastaviti prema navedenim temperaturama skladištenja.

Skladištenje. Čuvajte komplet reagensa na temperaturi od 2 do 25 C, osim reagensa za lizu. Reagens za lizu čuvajte u frižideru na temperaturi od 2 do 8 C.

Rashladne komore moraju osigurati regulirani temperaturni režim.

Lizirajući rastvor 30 cm 3 ,

Rastvor za pranje 1 30 cm 3 ,

Koncentrat za rastvor za čišćenje 2 20 cm 3 ,

Sorbentna suspenzija 2 cm 3,

Pufer za eluiranje DNK 4 cm 3 .

Operativni postupak:

Pripremite otopinu za pranje 2, za to pomiješajte 20 cm 3 koncentrata iz kompleta, 80 cm 3 destilovane vode i 100 cm3 96% etanola u posebnoj boci. Otopinu čuvajte na sobnoj temperaturi u bočici koja je dobro pričvršćena.

Provjerite stanje sorbenta - kada se taloži, trebao bi zauzeti približno polovinu volumena suspenzije.

U dobro zatvorenu polipropilensku epruvetu od 1,5 cm 3 (po mogućnosti sa poklopcem na navoj) dodajte 100 µl prethodno pripremljenog test uzorka, negativnog ili pozitivnog, dodajte 300 µl rastvora za lizu (u svaki uzorak sa posebnim vrhom) i dobro promiješajte pipetiranje 3-10 puta.

Dodati 15 - 20 µl resuspendiranog sorbenta, dobro promiješati na vorteksu, staviti u rešetku na 5-7 minuta za potpunu sedimentaciju sorbenta.

Sedimentirajte sorbent u mikrocentrifugi 30 sekundi pri 3-8 hiljada o/min. Uzmite supernatant iz svake epruvete sa posebnim vrhom (zgodno je koristiti vakuum usisavanje).

Dodati 300 μl otopine za ispiranje 1, miješati na vortexu dok se sorbent potpuno ne suspendira (ako se sorbent slabo razbije, razbiti ga pipetom), taložiti u centrifugi na 4-8 tisuća o/min 30 sekundi. Izvucite supernatant iz svake epruvete posebnim vrhom.

Dodati 800 μl otopine za ispiranje 2, miješati na vorteksu dok se sorbent potpuno ne suspendira, precipitirati na mikrocentrifugi na 6-10 hiljada okretaja u minuti 30 sekundi, uzeti supernatant.

Ponovite korak 6, pažljivo odaberite supernatant, osušite talog sorbenta u termostatu na 65°C 5 min.

Resuspendirajte sorbent u 30-40 µl pufera za eluiranje, stavite u termostat na 65°C 5 minuta, povremeno miješajući.

Sedimentirati na mikrocentrifugi maksimalnom brzinom od 1 min.

Uzorak je spreman za PCR, supernatant sadrži pročišćenu DNK.

Kao negativnu kontrolu u fazi ekstrakcije DNK potrebno je koristiti fiziološku ili deioniziranu vodu.

Efikasnost ekstrakcije DNK pomoću DNA-sorb-PCR kompleta je 30–60%.

klinički materijal	Plazma, serum	Struganje, sperma, ispiranje ždrijela, urin	Biopsija, krv, izmet
Broj pipetiranja
Volumen sorbenta
Stopa taloženja sorbenta	8 hiljada o/min	6 hiljada o/min	3-4 hiljade o/min
Volumen eluenta
Efikasnost ekstrakcije DNK

5.2. Faza 2. PCR setup sastav kompleta za PCR amplifikaciju:

5x reakcijski pufer 1000 µl (viskozni bistri plavi rastvor)

Dejonizirana voda.2000 µl

Smjesa nukleotida.500 µl

Taq polimeraza.100 µl

Primer mix.500 µl

Vosak za PCR.2000 µl

Pozitivna kontrola 100 µl

Negativna kontrola 100 µl

Mineralno ulje 4000 µl

Komplet se čuva na minus 20°C godinu dana.