A gyors mikrooszlopos DNS-kivonási módszer célja a teljes DNS izolálása a vérből, plazmából, nyálból, vizeletből, sejttenyészetekből és bármilyen pufferben lévő sejtpelletből. Az izolált DNS nagy tisztasága lehetővé teszi, hogy minden típusú elemzéshez felhasználható legyen.
- a DNS hatékony kötődése az oszlopmembránhoz lehetővé teszi a legmagasabb DNS-hozam elérését a mintából;
- a lizáló és mosóoldatok komponenseinek optimalizált összetételének köszönhetően nagyfokú tisztítás érhető el;
- szignifikánsan csökkenti a DNS fragmentációt és veszteséget mosás közben, összehasonlítva más szorbens extrakciós módszerekkel;
- lehetséges a DNS-koncentráció az elúciós oldat térfogatának csökkentésével;
- a DNS izolálása az oszlopokon jelentősen csökkenti a további műanyagok fogyasztását;
- maximális mintatérfogat - 200 µl;
- a készlet proteináz K-t tartalmaz;
- az izolált DNS tisztasága 1,8-1,9 az A260/A280 arány szerint;
- az izolált DNS mennyisége a minta típusától és mennyiségétől függ. A DNS hozama 200 µl vérből átlagosan 5-6 µg.
az izolálási idő 30-45 perc a minták számától függően;
Reagenskészlet a genomiális DNS extrakciójához "DNA-Extran"
A DNS-Extran sorozat genomiális DNS-ének kinyerésére szolgáló készletek segítségével számos biológiai anyagból lehet DNS-t izolálni: vérből, baktérium- és állati sejttenyészetekből, állatok és növények friss, fagyasztott vagy szárított szöveteiből.
- a DNS teljes kivonása a sejtekből, minimalizálva a DNS elvesztését és fragmentációját a tisztítás során;
- az izolált DNS nagy tisztaságú (A260/A280 arány = 1,8-1,9), és alkalmas PCR-re, restrikciós, hibridizációs és egyéb vizsgálatokra;
- a készletek nem tartalmaznak potenciálisan veszélyes összetevőket, például fenolt és kloroformot, nem igényelnek sok műanyagot és nem termelnek mérgező hulladékot.
Reagenskészlet DNS extrakcióhoz mágneses részecskéken "M-Sorb-Tub"
A mikobaktériumok DNS-ének köpetből, hörgőmosásokból, agy-gerincvelői folyadékból, váladékból, pontokból, biopsziából, vizeletből, nemi szervek váladékából, sejtkultúrákból történő izolálására alkalmas. A klinikai anyagok előzetes feldolgozását a mikrobiológiai vizsgálatokhoz szükséges minták előkészítésére vonatkozó szabványos eljárásoknak megfelelően végzik (Az Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériumának 2003. március 21-i 109. számú rendelete "Az oroszországi tuberkulózis elleni intézkedések javításáról" Föderáció", 11. függelék „Utasítás a mikrobiológiai vizsgálatok egységes módszereiről a tuberkulózis kimutatásában, diagnosztizálásában és kezelésében"). A klinikai anyag inaktiválásához javasoljuk az A inaktiváló oldatunk használatát.
Az A oldat 12 órán belül elpusztítja a mikobaktériumokat, és fertőtleníti a klinikai anyagot, amely további elemzésekhez (DNS extrakció, PCR stb.) használható. Az A oldat kifejezetten a köpet kezelésére lett kifejlesztve, és teljesen helyettesíti a NaOH-NALC oldatot használó standard eljárást, kivételes nyálkaoldó tulajdonságokkal rendelkezik. Az A inaktiváló oldat növeli a DNS-hozamot a standard NaOH-NALC minta-előkészítéshez képest.
Az izolálási eljárás a következőket tartalmazza: DNS-lízis guanidin-izotiocianáttal, DNS-szorpció mágneses részecskéken, DNS ülepítés centrifugálással, mosási lépések és DNS-elúció. Használható más mikroorganizmusok DNS-ének izolálására.
a szilikagél bevonatú mágneses részecskék szorbensként való alkalmazása technológiailag fejlettebb és kényelmesebb formátum a többi szorbenshez képest, lehetővé teszi a DNS extrakciós eljárás maximális szabványosítását és automatizálását;
minden vizsgálati mintához belső pozitív kontrollt (IPC) adunk, az RT-PCR inhibitorok jelenlétét/hiányát és a DNS extrakció hatékonyságát az IPC amplifikációs reakció alapján ítéljük meg.
Reagenskészletek DNS-kinyeréshez élelmiszertermékekből és élelmiszer-alapanyagokból
A „Sorb-GMO-A” és „Sorb-GMO-B” reagenskészleteket kifejezetten növényi anyagokból, élelmiszerekből és takarmányokból történő DNS-kinyerésre tervezték. Mindkét DNS-tisztító készlet szilícium-szorbenst használ. A "Sorb-GMO-A" lizálószerként guanidin-kloridot, a "Sorb-GMO-B" ionos detergenst, STAB-ot tartalmaz, amely a növényi összetevőkből származó DNS maximális hozamát biztosítja. A "Sorb-GMO-A" készlet megkülönböztető jellemzői a DNS-kivonás sebessége és a kloroform hiánya, ami biztonságosabbá teszi a készlettel való munkát.
Reagenskészlet vízmintákból DNS-kinyeréshez (mágneses részecskéken) "M-Sorb-Leg"
A legionella DNS izolálására tervezték a környezeti víztestekből (hűtőtornyok, úszómedencék, vízi parkok, hideg-meleg vízellátó rendszerek). A Legionella minimális visszanyert koncentrációja 100 sejt 0,5 liter mintánként.
Az "M-Sorb-Leg" készlet két változatban készül: "M-Sorb-Leg1000" 1-1000 ml térfogatú vízmintákhoz és "M-Sorb-Leg1" vízmintákhoz 1 ml-ig. Az M-Sorb-Leg1000 készlet biztosítja a víz szűrését polikarbonát szűrővel.
- A DNS-izolálási technika szilikagéllel bevont mágneses részecskék DNS-szorpcióján alapul, amelyet kicsapó reagenssel történő kicsapás követ. Egyesíti a szorpciós módszerek és a teljes kicsapás módszerének előnyeit;
- minden tesztmintához belső pozitív kontrollt (IPC) adunk, és az RT-PCR inhibitorok jelenlétét/hiányát az IPC amplifikációs reakció alapján ítéljük meg.
az "M-Sorb-Leg" reagenskészlet lehetővé teszi, hogy megszabaduljon a nagyon szennyezett vízmintákban lévő PCR-gátlóktól;
Reagenskészlet környezeti tárgyakból DNS-kinyeréshez (mágneses részecskéken) "M-Sorb-OOM"
Az M-Sorb-OOM reagenskészletet arra tervezték, hogy DNS-t izoláljon olyan környezeti objektumoktól (talaj, víz, állati tetemek stb.), amelyekről feltételezhető, hogy nagyon veszélyes mikroorganizmusokkal (OOM) fertőződtek, hogy előkészítsék őket a későbbi, valós vizsgálatra. idő PCR. Az extrakciós eljárás hasonló az M-Sorb-Leg készletnél leírtakhoz.
Reagenskészlet RNS izolálásához "RNA-Extran"
A készlet RNS izolálására szolgál vérből, szövetfragmensekből, sejttenyészetekből. Az RNA-Extran kittel nyert RNS felhasználható RT-PCR-re és hibridizációs elemzésre, in vitro transzlációra és klónozásra.
Az RNS izolálás elve Chomchinsky szerint savas fenolos extrakción alapul, amelyben csak az RNS marad a vizes fázisban, és a DNS fehérjékkel kombinálva a szerves fázisba kerül. A guanidin-tiocianátot olyan szerként használják, amely izolálja és denaturálja a sejtnukleázokat.
- RNS extrakciós idő - 1 óra.
lehetővé teszi nagy tisztaságú, DNS-szennyeződésektől mentes RNS előállítását;
biztosítja az RNS teljes kivonását teljes vérből, szövetfragmensekből és sejttenyészetekből;
lehetővé teszi, hogy ép RNS-t kapjon;
| Katalógusszám | cím | reakciók száma |
| EX-509 | „DNA-Extra-1” reagenskészlet genomi DNS teljes vérből történő izolálásához | 100 |
| EX-511 | „DNA-Extran-2” reagenskészlet állati és emberi szövetekből történő DNS-kinyeréshez | 100 |
| EX-512 | „DNA-Extran-3” reagenskészlet baktériumtenyészetekből DNS-kinyeréshez | 100 |
| EX-513 | „DNA-Extra-4” reagenskészlet DNS-kinyeréshez növényi szövetekből | 100 |
| EX-514 | „K-Sorb” reagenskészlet a teljes DNS izolálásához oszlopokon (vérből, nyálból, vizeletből, sejttenyészetekből, hámsejtek kaparékából) | 100 |
| EX-515 | "RNA-Extra" reagenskészlet RNS izolálásához vérből, szövetekből, sejttenyészetekből | 50 |
| OM-505 | „M-Sorb-Tub” reagenskészlet klinikai mintákból és sejttenyészetekből DNS-kinyeréshez (mágneses részecskéken) | 50 vagy 100 |
| GM-502-50 | „SORB-GMO-A” (guanidin + szorbens) Reagenskészlet DNS-kinyeréshez növényi nyersanyagokból és élelmiszertermékekből | 50 |
| GM-503-50 | „SORB-GMO-B” (CTAB + szorbens) Reagenskészlet DNS-kinyeréshez növényi nyersanyagokból és élelmiszertermékekből | 50 |
| OM-506 | „M-Sorb-Leg1000” reagenskészlet a legionella DNS izolálásához vízmintákból 1000 ml-ig (a mágneses részecskéken a szűrőket külön szállítjuk) | 50 vagy 100 |
| OM-507 | „M-Sorb-Leg1” reagenskészlet a legionella DNS izolálásához vízmintákból 1 ml-ig (mágneses részecskéken) | 50 vagy 100 |
| OOM-502 | „M-sorb-OOM” reagenskészlet DNS-kinyeréshez környezeti tárgyakból (mágneses részecskéken) | 50 vagy 100 |
Rendelési információ
| Név | Hangerő | Termelés | Módszer | Kat.szám |
|---|---|---|---|---|
| „GMO-MagnoSorb” (guanidin + mágneses szorbens) Reagenskészlet DNS-kinyeréshez növényi nyersanyagokból és élelmiszertermékekből | 50 váladék | Synthol | valós idejű PCR | GM-505-50 |
| „SORB-GMO-A” (guanidin + szorbens) Reagenskészlet DNS-kinyeréshez növényi nyersanyagokból és élelmiszertermékekből | 50 | Synthol | valós idejű PCR | GM-502-50-50 |
| „SORB-GMO-B” (CTAB + szorbens) Reagenskészlet DNS-kinyeréshez növényi nyersanyagokból és élelmiszertermékekből | 50 | Synthol | valós idejű PCR | GM-503-50-50 |
| „Amplitub-RV” reagenskészlet No. 1 („M-Sorb-Tub“) a mikobaktériumok DNS-ének izolálására klinikai mintákból és sejttenyészetekből (mágneses részecskéken) | 50 | Synthol | valós idejű PCR | OM-505 |
| „DNA-Extra-1” reagenskészlet genomi DNS teljes vérből történő izolálásához | 100 | Synthol | valós idejű PCR | EX-509-100 |
| „DNA-Extran-2” reagenskészlet állati és emberi szövetekből történő DNS-kinyeréshez | 100 | Synthol | valós idejű PCR | EX-511 |
| „DNA-Extran-3” reagenskészlet baktériumtenyészetekből DNS-kinyeréshez | 100 | Synthol | valós idejű PCR | EX-512-100 |
| „DNA-Extran-3” reagenskészlet DNS-kinyeréshez növényi szövetekből | 100 | Synthol | valós idejű PCR | EX-513-100 |
| „K-Sorb” reagenskészlet a teljes DNS izolálásához oszlopokon (vérből, nyálból, vizeletből, sejttenyészetekből, hámsejtek kaparékából) | 100 | Synthol | valós idejű PCR | EX-514-100 |
| 48 reakció | Synthol | valós idejű PCR | GM-443-48 | |
| Szója / 35S+FMV / NOS szűrőreagens készlet | 50 reakció | Synthol | valós idejű PCR | GM-416-50 |
""DNS-sorb-S-M" ® AmpliSense FBUN Roszpotrebnadzor Központi Epidemiológiai Kutatóintézete, Kizárólag kutatási célokra Oroszország, 111123, Oroszország, 111123, és egyéb nem orvosi célokra, Moszkva városa, ..."
UTASÍTÁS
a reagenskészlet használatáról
biológiai anyagból DNS-kinyeréshez
"DNS-sorb-S-M"
AmpliSense
FBUN Központi Epidemiológiai Kutatóintézet
Rospotrebnadzor,
Csak kutatásra
Orosz Föderáció, 111123,
és egyéb nem gyógyászati célokra
Moszkva, Novogireevskaya utca, 3A
RÖVIDÍTÉSEK LISTÁJA
CÉLJA
A MÓDSZER ELVE
CSOMAGALAPOK
DNS KIVONÁSA ÁLLATOKBÓL BIOLÓGIAI ANYAGBÓL................................................. 8
ÁLLATI ÉTEL VAGY NÖVÉNYI TÁPLÁLÉKNYOMTATÁSI TERMÉKEKBEN HASZNÁLT SZIMBÓLUMOK
1. űrlap: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 2/15 oldal
RÖVIDÍTÉSEK LISTÁJA
Ebben a kézikönyvben a következő rövidítéseket és szimbólumokat használjuk:
DNS - dezoxiribonukleinsav NA - nukleinsavak TC - negatív extrakciós kontroll NCO - negatív kontroll minta PC - pozitív extrakciós kontroll PKO - pozitív kontroll minta PCR - polimeráz láncreakció
– Szövetségi költségvetési tudományos intézmény
FBUN CRI
A Rospotrebnadzor Fogyasztói Jogok Védelmével és Emberi Jólétével foglalkozó Szövetségi Felügyeleti Szolgálat "Epidemiológiai Központi Kutatóintézete"CÉLJA
A "DNS-sorb-S-M" reagenskészlet állatokból származó biológiai anyagokból származó DNS-kinyerésre szolgál: szövet (biopszia (az urogenitális rendszer bőre és nyálkahártyái, gyomor-bél traktus, hörgők), sebészeti és boncolási) anyag; és DNS kinyerése élelmiszerekből, biológiai adalékokból, állati takarmányokból vagy növényi anyagokból polimeráz láncreakcióval (PCR) történő későbbi elemzés céljából.A DNS-kivonás a PCR-módszer analitikai előtti eljárása.
Az extrakcióhoz szükséges mintatérfogat: 100 µl (10-100 µl térfogatú vagy 10-100 mg tömegű minták vizsgálhatók)1.
FIGYELEM! A begyűjtési eljárásról, a vizsgálati anyag szállításának és tárolásának feltételeiről, a DNS-kivonásra való előkészítés szükségességéről és eljárásáról, valamint a zavaró anyagokról és a mintával kapcsolatos korlátozásokról a használt amplifikációs reagenskészlet használati útmutatójában olvashat. .
A MÓDSZER ELVE
A tesztmintát2 proteináz K-t tartalmazó lizáló oldattal kezeljük, ami a sejtmembránok tönkremeneteléhez, NA és sejtkomponensek felszabadulásához vezet. Az oldott NA-k a szorbens részecskéihez kötődnek, míg a lizált vizsgálati anyag egyéb komponensei oldatban maradnak és a szorbens kicsapása során eltávolítódnak.A vizsgált anyagtól függően lásd az alkalmazott amplifikációs készlet használati utasítását.Bizonyos típusú biológiai anyagok esetében minta-előkészítési lépésre van szükség. Cm.
a használt amplifikációs reagenskészletre vonatkozó utasításokat.
1. forma: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 3/15 oldal centrifugálással és a szorbens ezt követő mosásával. Amikor az elúciós puffert a szorbenshez adjuk, az NC a szilícium-dioxid felületéről az oldatba kerül, amelyet centrifugálással választanak el a szorbens részecskéktől. Az eljárás eredményeként egy nagy tisztaságú, az amplifikációs reakciót gátló anyagoktól mentes NA készítményt kapunk, amely biztosítja a PCR vizsgálat nagy analitikai érzékenységét.
CSOMAGALAPOK
A reagenskészlet 2 konfigurációban kapható:
Az 1. formanyomtatvány tartalmazza a "DNA-sorb-S-M" 50-es verziójú reagenskészletet.
A 2-es formanyomtatvány tartalmazza a "DNA-sorb-S-M" 100-as verziójú reagenskészletet.
BIZTONSÁGI ÓVINTÉZKEDÉSEK ÉS ÁRTALMATLANÍTÁSI INFORMÁCIÓK
Az állatokból származó biológiai anyagok vizsgálatakor a munkát az Orosz Föderáció Mezőgazdasági Minisztériumának 1997. január 27-i, 13-7-2 / 840 „A polimerázt használó diagnosztikai laboratóriumokban végzett munka szabályai” című szabályai szerint kell végezni. láncreakciós módszer. Alapvető rendelkezések” címmel jóváhagyta az Állategészségügyi Osztály.Élelmiszerek, biológiai adalékanyagok, állati takarmányok vagy növényi nyersanyagok vizsgálatakor a munkát az MU 1.3.2569-09 „A nukleinsav-amplifikációs módszereket használó laboratóriumok munkájának megszervezése anyaggal való munka során” című irányelv követelményeinek megfelelően kell végezni. I–IV. patogenitási csoportba tartozó mikroorganizmusokat tartalmazó "és GOST R 53214-2008" Élelmiszeripari termékek. Analitikai módszerek genetikailag módosított szervezetek és az azokból származó termékek kimutatására.
Általános követelmények és meghatározások”.
Munka közben mindig be kell tartania a következő követelményeket:
– A laboratóriumi folyamatnak egyirányúnak kell lennie. Az elemzést külön helyiségekben (zónákban) végzik. A munkát az extrakciós zónában kell elkezdeni, és az erősítési és észlelési zónában kell folytatni. Ne vigye vissza a mintákat, berendezéseket és reagenseket arra a területre, ahol az előző eljárási lépést végrehajtották.
– Fel nem használt reagensek, lejárt szavatosságú reagensek és 1. forma: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 15 használt reagensből 4. oldal, csomagolás3, biológiai anyagok, beleértve az anyagokat, eszközöket és tárgyakat, a szennyezett biológiai anyagokat ártalmatlanítani kell a SanPiN 2.1.7.2790-10 „Az egészségügyi hulladék kezelésének egészségügyi és járványügyi követelményei” követelményeinek megfelelően.
– Használja és cserélje ki minden egyes műveletnél az eldobható hegyeket szűrővel ellátott automata pipettákhoz4. Az eldobható műanyag edényeket egy speciális edénybe kell dobni, amely fertőtlenítőszert tartalmaz, amely alkalmas az orvosi hulladékok fertőtlenítésére.
– A minta-előkészítéshez használt edényeket (mozsártörő) és fémeszközöket (szike, olló, csipesz, turmixtartozékok stb.) fertőtlenítő oldatban (például 0,2%-os diklór-izocianursav-nátriumsó-oldatban) egy órán át tartjuk, mossuk. csapvízzel felületaktív mosószerekkel, majd folyó és ionmentesített vízben történő mosás után száraz hőkamrában 4 órán át 180 C-on szárítjuk.
– A reagenskészlet egyszeri használatra szolgál, meghatározott számú minta tesztelésére (lásd az „Összetétel” részt).
– A reagenskészlet készen áll a használati utasítás szerint.
A reagenskészletet szigorúan a rendeltetésének megfelelően használja.
– Ne használja a reagenskészletet, ha a belső csomagolása törött, vagy a reagens megjelenése nem felel meg a leírásnak.
– Ne használja a reagenskészletet, ha nem tartották be az utasítások szerinti szállítási és tárolási feltételeket.
A fel nem használt reagensek, lejárt szavatosságú reagensek, használt reagensek, csomagolások a G egészségügyi hulladékok veszélyességi osztályába tartoznak.
Szűrő nélküli eldobható hegyeket használnak a felülúszó eltávolítására a vákuumszívóval történő extrakció során.
1. űrlap: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 5/15 oldal
– Ne használja a reagenskészletet a lejárati időn túl.
– Használjon eldobható púdermentes kesztyűt, laborköpenyt és szemvédőt a minták és reagensek kezelésekor. A munka végén alaposan mosson kezet. Minden műveletet csak kesztyűben végeznek, hogy elkerüljék az emberi testtel való érintkezést.
– Kerülje a gőzök belélegzését, bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezését, ne nyelje le. Érintkezés esetén azonnal öblítse le vízzel az érintett területet, és szükség esetén forduljon orvoshoz.
– A reagens biztonsági adatlapok (SDS) kérésre rendelkezésre állnak.
Valószínű események felmérése, amelyek következtében az emberi szervezetre negatív következmények léphetnek fel:
Rendeltetésszerű használat és a fenti óvintézkedések betartása esetén az emberi testtel való érintkezés kizárt.
Vészhelyzetekben a következők lehetségesek:
- érzékeny személyeknél a szem nyálkahártyájának irritációja,
- bőrirritáció érzékeny személyeknél,
- allergiás reakció,
- belélegzés által okozott károk,
- szájon át történő bevétel esetén ártalmas.
A reagenskészlet specifikus hatásai az emberi szervezetre:
- Nincs rákkeltő hatás.
- Nincs mutagén hatás.
– Nincs reprodukciós toxicitás.
TOVÁBBI ANYAGOK ÉS BERENDEZÉSEK
(a gyártók/beszállítók feltüntetésével):1. Eldobható 1,5 ml-es és 5,0 ml-es polipropilén csavaros vagy szoros dugós csövek (pl. Axygen, Inc.
(Exgen, Inc.), USA vagy ezzel egyenértékű).
2. Eldobható hegyek változó térfogatú pipettákhoz 200 és 1000 µl-es szűrővel (például Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA vagy hasonló).
3. Eldobható hegyek 200 µl-ig változó térfogatú pipettákhoz (pl. Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA vagy hasonló).
1. űrlap: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 6/15 oldal
4. 1,5 ml-es tubustartók (például Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA vagy hasonló).
5. A típusú II. biológiai biztonsági osztályú lamináris doboz (például "BAVp-01-"Laminar-S"-1.2", CJSC "Laminar Systems", Oroszország vagy hasonló).
6. Termosztát "Eppendorf" típusú csövekhez 25-100 °C (például SIA Biosan, Lettország vagy hasonló).
7. Termosztát-rázó Eppendorf típusú csövekhez 25 és 100 °C között (például TS-100, SIA Biosan, Lettország vagy hasonló).
8. Mikrocentrifuga Eppendorf típusú csövekhez, legalább 12 ezer g maximális centrifugálási sebességgel (például MiniSpin, Eppendorf ("Eppendorf Manufacturing Corporation"), Manufacturing Corporation Germany vagy hasonlók).
9. Vortex (például SIA Biosan, Lettország vagy hasonló).
10. Orvosi vákuumszívó csapólombikkal a felülúszó eltávolítására (például OM-1, OOO Utes, Oroszország vagy hasonló).
11. Változó térfogatú automata adagolók (például Biohit LLC, Oroszország vagy hasonlók).
12. Hűtőszekrény 2 és 8 °С között, fagyasztóval mínusz 24 és mínusz 16 С között.
13. Külön pongyola, sapkák, cipők és eldobható kesztyűk az MU 1.3.2569-09 szerint.
14. Eldobható műanyag edények anyagfelszabadításhoz és inaktiváláshoz.
– – –
DNS KIVONÁSA BIOLÓGIAI ANYAGBÓL ÁLLATOKBÓL
2. Válassza ki a szükséges számú, csavaros kupakkal vagy szorosan záródó kupakkal ellátott, eldobható 1,5 ml-es polipropilén csövet (beleértve a negatív és pozitív extrakciós kontrollokat is, ha a PCR vizsgálathoz rendelkezésre állnak).
Ha a lizáló puffert és az 1. mosóoldatot 2-8 °C hőmérsékleten tároljuk, kristályok formájában csapadék képződhet.
1. űrlap: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 8/15. oldal
3. Adjon minden csőhöz 10 µl VKO6-ot (ha PCR-vizsgálathoz biztosított). Adjon 400 µl lizáló puffert és 17 µl lizáló puffert a csövekhez.
4. Adjon ki 100 µl vizsgálati mintát6 előkészített csövekbe, minden mintához külön szűrőhegyet használva.
FIGYELEM! 400 µl lizáló puffert és 17 µl lizáló reagenst adhatunk a csőbe a szükséges mennyiségű vizsgált mintával, és 10 µl BKO7-et (ha a PCR vizsgálathoz biztosított) ugyanabba a csőbe külön szűrőhegyek segítségével.
5. Adjon 100 µl OKO-t a negatív kontroll (TC) extrakciós csőhöz, adjon hozzá 90 µl OKO-t és 10 µl FKO-t a pozitív kontroll (PC) extrakciós csőhöz (ha a PCR-vizsgálatok elvégzéséhez extrakciós kontrollokat biztosítunk).
6. Szorosan zárja le a fedőket, alaposan keverje össze és keverje össze a cseppeket.
Helyezze a csöveket 64°C-os termosztátba 1 órára, időnként vortexelve (5-ször 10-12 percenként). Az inkubálást 12 órán át 60 °C-on hagyjuk.
7. Ültesse le a fel nem oldott mintarészecskéket centrifugálással 5 percig 10 kg-on (pl. 12 krpm MiniSpin mikrocentrifugánál, Eppendorf Manufacturing Corporation).
8. Nagyon óvatosan távolítsa el a felülúszót 200-350 µl-es térfogatban (elkerülve a szuszpendált részecskék és zsírcseppek bejutását), külön szűrőkkel ellátott hegyekkel, és vigye át új kémcsövekbe. A cseppek leülepedése az örvényen.
9. Az univerzális szorbenst vortexen intenzíven keverve szuszpendálja újra. Adjon hozzá 25 µl újraszuszpendált univerzális szorbenst minden egyes kémcsőhöz külön heggyel, és szorosan zárja le a fedelet.
Vortexelje, hagyja állványon 10 percig, 2 percenként keverje meg.
A teszt- és kontrollminták térfogatának változtatása megengedett, lásd a használt amplifikációs reagenskészletre vonatkozó utasításokat.
1. űrlap: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 9/15. oldal
18. Ismételje meg a mosási eljárást a következő bekezdések szerint. 15–16, távolítsa el teljesen a felülúszót.
19. Helyezze a nyitott fedelű kémcsöveket 64 °C-os termosztátba 5–10 percre, hogy megszáradjon az univerzális szorbens.
20. Adjon 50–100 µl B elúciós puffert a csövekhez (lásd a használt amplifikációs reagenskészletre vonatkozó utasításokat).
Vortexelje, amíg a szorbens teljesen fel nem szuszpendálódik. Helyezze 5-10 percre 64 °C-os termosztátba, időnként (percenként 1-szer) örvényen keverve.
A tisztított DNS 2-8 °C-on egy hétig, mínusz 24-16 °C-on 6 hónapig, mínusz 68 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten egy évig tárolható. Ehhez a szorbens felfogása nélkül át kell tölteni a felülúszót egy új kémcsőbe.
1. űrlap: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 10/15 oldal
DNS KIVONÁS ÉLELMISZEREKBŐL, BIOLÓGIAI KIEGÉSZÍTŐK,
ÁLLATI ÉTEL VAGY NÖVÉNYI TÁPLÁLÉK
FIGYELEM! A DNS-kivonáshoz szükséges biológiai anyag előkészítésének eljárásával és a vizsgálati minta térfogatával kapcsolatban lásd az amplifikációhoz használt reagenskészlet utasításait.1. Melegítse fel a lizáló puffert és az 1. mosóoldatot, ha 2-8°C-on tárolja, 64°C-ra, amíg a kristályok teljesen fel nem oldódnak.
2. Helyezzen 1,5 ml-es, előkezelt tesztmintákat tartalmazó csöveket egy állványra (lásd a minta térfogatára/mennyiségére vonatkozó amplifikációs reagenskészletre vonatkozó utasításokat).
3. Készítsen elő egy eldobható 1,5 ml-es polipropilén csövet csavaros kupakkal vagy szorosan záródó negatív extrakciós kontrollal (EC). Adjon 100 µl OKO-t a kémcsőbe.
4. Adjon hozzá 400 µl lizáló puffert és 17 µl lizáló reagenst a kémcsövekbe és az OC-kbe.
5. Szorosan zárja le a fedőket, alaposan keverje össze és keverje össze a cseppeket.
Helyezze a kémcsöveket 1 órára 64 °C-os termosztátba, időszakonként vortexelve (5-ször 10-12 percenként), vagy használjon termosztát-rázót.
6. A fel nem oldott mintarészecskéket 5 perces, 10 kg-os centrifugálással ülepítse le (pl. 12 krpm MiniSpin mikrocentrifugánál, Eppendorf Manufacturing Corporation).
7. Válassza ki a szükséges számú új eldobható 1,5 ml-es csavaros kupakkal vagy szorosan záródó kupakkal ellátott polipropilén csövet.
8. Az univerzális szorbenst vortexen intenzíven keverve szuszpendálja újra. Adjon hozzá 25 µl újraszuszpendált univerzális szorbenst minden egyes kémcsőhöz külön heggyel, és szorosan zárja le a fedelet.
9. A lizált mintákat tartalmazó csövekből nagyon óvatosan (elkerülve a szuszpendált részecskék és zsírcseppek bejutását) távolítsa el a felülúszó folyadékot 200-350 µl térfogatban, külön szűrős hegyekkel, és vigye át szorbenses csövekbe. Vortexelje, hagyja állványon 10 percig, 2 percenként keverje meg.
1. űrlap: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / 11/15 oldal
10. Centrifugálja a csöveket mikrocentrifugában 1 percig 2 kg-mal (pl. 5 krpm MiniSpin mikrocentrifugához, Eppendorf Manufacturing Corporation).
11. Anélkül, hogy megfogná a szorbenst, távolítsa el a felülúszót minden csőből egy külön 200 µl-es szűrő nélkül, vákuumszívó segítségével.
12. Adjon hozzá 300 µl 1. mosóoldatot a csövekhez, szorosan zárja le a fedelet, vortexelje, amíg az univerzális szorbens teljesen újraszuszpendálódik.
13. Centrifugálja a csöveket mikrocentrifugában 1 percig 2000 g-vel.
14. Anélkül, hogy megfogná a szorbenst, távolítsa el a felülúszót minden csőből egy külön 200 µl-es szűrő nélkül, vákuumszívó segítségével.
15. Adjon hozzá 500 µl 2. mosóoldatot a csövekhez, szorosan zárja le a fedelet, keverje vortex segítségével, amíg az univerzális szorbens teljesen fel nem szuszpendálódik.
16. Centrifugálja a csöveket mikrocentrifugában 1 percig 7 kg-mal (pl. 10 krpm MiniSpin mikrocentrifugához, Eppendorf Manufacturing Corporation).
17. Anélkül, hogy megfogná a szorbenst, távolítsa el a felülúszót minden csőből egy külön 200 µl-es szűrő nélkül, vákuumszívó segítségével.
18. Ismételje meg a mosási eljárást a következő bekezdések szerint. 15-16, távolítsa el teljesen a felülúszót.
19. Helyezze a nyitott fedelű kémcsöveket 64 °C hőmérsékletű termosztátba 5-10 percre, hogy az univerzális szorbens megszáradjon.
20. Adjon 50 µl B elúciós puffert a csövekhez, és vortexelje addig, amíg a szorbens teljesen újraszuszpendálódik. Helyezze 5-10 percre 64 °C-os termosztátba, időnként (percenként 1-szer) örvényen keverve.
21. Centrifugálja a csöveket mikrocentrifugában 1 percig 10 ezer g-vel. A felülúszó tisztított DNS-t tartalmaz. A minták készen állnak a PCR-re.
A tisztított DNS 2 és 8 °C közötti hőmérsékleten egy hétig, -24 és -16 °C közötti hőmérsékleten 6 hónapig és 1. forma hőmérsékleten: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / 12/15 oldal nem magasabb mínusz 68 °С-nál az év során. Ehhez a szorbens felfogása nélkül át kell tölteni a felülúszót egy új kémcsőbe.
LEJÁRATI IDŐ, SZÁLLÍTÁSI ÉS TÁROLÁSI FELTÉTELEK.
Legjobb megadás dátuma. 12 hónap Lejárt reagenskészletet nem szabad használni. A felbontott reagensek lejárati ideje a bontatlan reagensek címkéjén feltüntetett lejárati idő, hacsak az útmutató másként nem rendelkezik.Szállítás. A reagenskészletet 2 és 8 C közötti hőmérsékleten legfeljebb 5 napig kell szállítani jégcsomagokat tartalmazó termikus konténerekben minden típusú fedett járművel. Átvételkor szerelje szét a megadott tárolási hőmérsékletnek megfelelően.
Tárolás. A reagenskészletet a lizáló reagens kivételével 2 és 25 C közötti hőmérsékleten tárolja. Tárolja a lizáló reagenst hűtőszekrényben, 2-8 C hőmérsékleten.
A hűtőkamráknak szabályozott hőmérsékleti rendszert kell biztosítaniuk.
Lizáló oldat 30 cm 3 ,
Mosóoldat 1 30 cm 3 ,
Koncentrátum tisztítóoldathoz 2 20 cm 3,
Szorbens szuszpenzió 2 cm 3,
DNS-elúciós puffer 4 cm 3 .
Működési eljárás:
Készítse elő a 2. mosóoldatot, ehhez keverjen össze 20 cm 3 készletből származó koncentrátumot, 80 cm 3 desztillált vizet és 100 cm 3 96%-os etanolt egy külön üvegben. Az oldatot szobahőmérsékleten, szorosan csavart injekciós üvegben tárolja.
Ellenőrizze a szorbens állapotát - ülepedéskor a szuszpenzió térfogatának körülbelül felét kell elfoglalnia.
Egy szorosan lezárt, 1,5 cm 3 -es polipropilén csőbe (lehetőleg csavaros kupakkal) adjunk 100 µl előzetesen elkészített negatív vagy pozitív vizsgálati mintát, adjunk hozzá 300 µl lizálóoldatot (minden mintához külön heggyel), és alaposan keverjük össze pipettázás 3-10 alkalommal.
Adjunk hozzá 15-20 µl újraszuszpendált szorbenst, keverjük jól vortexen, tegyük egy állványra 5-7 percre a szorbens teljes ülepedéséhez.
A szorbenst mikrocentrifugában 30 másodpercig, 3-8 ezer ford./perc sebességgel ülepítse. Vegye ki a felülúszót minden csőből külön heggyel (kényelmes vákuumszívás használata).
Adjunk hozzá 300 μl mosóoldatot 1, keverjük vortex-en a szorbens teljes reszuszpendálásáig (ha a szorbens rosszul törik, pipettával törjük meg), centrifugában csapjuk ki 4-8 ezer fordulat/perc sebességgel 30 mp-ig. Távolítsa el a felülúszót minden csőből külön hegyével.
Adjunk hozzá 800 μl 2-es mosóoldatot, keverjük vortex-en, amíg a szorbens teljesen fel nem szuszpendálódik, csapjuk ki mikrocentrifugán 6-10 ezer ford./perc sebességgel 30 másodpercig, vegyük ki a felülúszót.
Ismételje meg a 6. lépést, óvatosan válassza ki a felülúszót, szárítsa meg a szorbens csapadékot termosztátban 65 °C-on 5 percig.
Reszuszpendálja a szorbenst 30-40 µl elúciós pufferben, helyezze termosztátba 65°C-on 5 percre, időnként vortexelve.
Mikrocentrifugán, maximum 1 perc sebességgel ülepedjen le.
A minta készen áll a PCR-re, a felülúszó tisztított DNS-t tartalmaz.
Negatív kontrollként a DNS-kivonás szakaszában sóoldatot vagy ionmentesített vizet kell használni.
A DNS-kivonás hatékonysága a DNS-szorb-PCR készlettel 30-60%.
|
klinikai anyag |
Plazma, szérum |
Kaparás, sperma, garatmosások, vizelet |
Biopszia, vér, széklet |
|
Pipettázások száma | |||
|
Szorbens térfogat | |||
|
Szorbens ülepedési sebesség |
8 ezer ford./perc |
6 ezer ford./perc |
3-4 ezer ford./perc |
|
Eluens térfogata | |||
|
DNS-kivonási hatékonyság |
5.2. 2. szakasz. A PCR-amplifikációs készlet PCR-beállítási összetétele:
5x reakciópuffer. 1000 µl (viszkózus tiszta kék oldat)
Ionmentesített víz.2000 µl
Nukleotid keverék.500 µl
Taq polimeráz.100 µl
Primer mix.500 µl
Viasz PCR-hez.2000 µl
Pozitív kontroll 100 µl
Negatív kontroll 100 µl
Ásványi olaj 4000 µl
A készletet mínusz 20°C-on egy évig tárolják.
